我院原雪峰團隊《Biology》發(fā)文：植物RNA病毒突變修復的多層次觸發(fā)因素，對弱毒疫苗應用的重要提示

2022年7月13日，植物保護學院原雪峰教授領銜的分子植物病毒學研究團隊，在國際生物學期刊《Biology》在線發(fā)表了題為“Multiple levels of triggered factors and the obligated requirement of cell-to-cell movement in the mutation repair of cucumber mosaic virus with defects in the tRNA-like structure”論文。該研究為植物RNA病毒分子進化和弱毒疫苗實際應用提供了重要參考，具有重要理論價值和應用借鑒。

RNA病毒進化出多種機制維持基因組的穩(wěn)定性和健康度，如負選擇（又稱為凈化選擇）會刪除那些因突變嚴重喪失健康度（fitness）的病毒變體；而病毒特有的低保真度復制酶又會使那些因突變部分喪失健康度的病毒變體通過不同機制趨向回復成野生型，其中RNA重組是重要機制之一。解析回復突變的觸發(fā)因素對于深入了解病毒分子進化至關重要，目前對于突變回復的觸發(fā)因素研究不夠深入。

本研究以三分體病毒-黃瓜花葉病毒CMV為研究對象，對調控病毒復制的核心元件TLS（tRNA-like structure）進行致畸突變，分析其潛在回復突變的觸發(fā)因素。突變體接種實驗顯示，不同RNA（RNA1、RNA2和RNA3）的TLS突變體致病性差異明顯，暗示了RNA1、RNA2和RNA3中TLS的作用以及調控機制的差異。同時發(fā)現，RNA1、RNA2和RNA3的TLS突變在高濃度農桿菌（OD₆₀₀=1.2）浸潤接種時回復突變率有明顯差異（0到80%的巨大差異）。同樣的TLS突變出現差異極大的回復突變率，暗示其回復突變的觸發(fā)因素不同。Northern blot分析發(fā)現，TLS突變對不同RNA的合成存在明顯的差異，TLS突變幾乎不影響RNA1相對合成量、顯著降低RNA2的相對合成量、顯著改變RNA3及其亞基因組RNA4的大小。因此。突變回復的第一層次觸發(fā)因素為TLS突變對相應RNA合成的影響程度；造成質變（RNA3的大小變化）的回復突變率最高（67-80%），量變（RNA2的相對降低）的回復突變率次之（35-46%）。研究表明，TLS回復突變的機制為模板依賴型的RNA重組。

進一步研究表明，高濃度接種時不發(fā)生回復突變的RNA1 TLS突變體，若混合2b蛋白（CMV編碼的基因沉默抑制因子）突變同時接種，則回復突變率為100%。暗示可能是基因組整體復制量的低水平導致回復突變。隨后的RNA1 TLS突變體的梯度稀釋接種實驗表明，稀釋至野生型CMV病毒的稀釋限點（OD₆₀₀=1.2X10^-4）時，回復突變發(fā)生。說明，回復突變的第二層次是初始接種濃度的高低，接近野生型稀釋限點的接種濃度容易觸發(fā)回復突變。

進一步實驗表明，不同類型的TLS突變體若混合細胞間運動缺陷型RNA3同時接種，則回復突變率均為0。無論接種濃度高還是低，只要細胞間運動缺陷型RNA3存在，則回復突變無法產生。因此回復突變的第三層次因素是細胞間運動的存在。

本研究揭示了回復突變的三個層次的觸發(fā)因素，對于植物病毒的分子進化（尤其是弱毒變?yōu)閺姸荆┯兄匾膮⒖純r值。另外，為弱毒疫苗的實際應用提供了重要的借鑒。創(chuàng)制良好的弱毒疫苗時，首先要檢測疫苗的穩(wěn)定性，即排除第一層次的回復突變觸發(fā)因素；在疫苗實際應用時，則要盡可能避免其他層次的回復突變觸發(fā)因素。不能低濃度接種弱毒疫苗；另外弱毒疫苗的介體傳播特性要突變去除，否則會在介體傳播時造成低濃度接種的效果。弱毒疫苗的稀釋接種實驗印證了這一點，弱毒疫苗（R2-2bPT-1或R2-2bPT-1）在稀釋至1.2X10^-3-1.2X10^-4之間時，開始發(fā)生突變回復現象，嚴重影響疫苗的安全性。

本研究第一作者為已畢業(yè)博士生劉珊珊（目前在中國農科院煙草所從事博士后研究），二年級碩士生牟金澤提供了弱毒疫苗深度稀釋接種后發(fā)生突變回復的數據，原雪峰教授為論文通訊作者。本研究得到國家自然科學基金項目（32072382, 31872638）資助。

原文鏈接

https://doi.org/10.3390/biology11071051